量子点免疫层析技术简介
免疫层析技术(immunochromatographic test strip，ICTS)是将膜层析技术与免疫标记相结合的检测技术。作为快速诊断试剂，因其操作简便、检测时间短、成本低廉、适用于现场检测（Point-of-care test, POCT）等优点，在生物医学、食品安全、农药残留、环境污染物检测中已得到广泛应用。免疫层析中常常引入标记材料，如胶体金、彩色乳胶、上转换颗粒等，以可视化检测区抗原抗体反应。新型发光材料量子点(Quantum dots)更是因为其优异的光学特性在免疫生物学和临床检验学等研究中显示出极大的应用价值。
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量子点，又称半导体纳米晶，粒径约2-10纳米，主要由II～Ⅵ族或 III～V 族元素组成，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光。其研究源于20世纪70年代末。与其他免疫标记材料相比：
① 量子点荧光强度高、稳定性好、抗漂白能力强；
② 激发光谱宽，发射光谱较窄且呈对称分布使得量子点可以用于多种组分的多色标记，实现多组份同步检测；
③ 生物相容性好，尤其是经过各种化学修饰之后，可以进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，更适用于生物活体标记和检测。
量子点纳米球(Quantum dots nanobeads，QDNBs)是通过高聚物载体上吸附或包埋量子点而形成的一种标记物。一般通过层层自组装或者嵌入包埋等方式进行合成。研究表明，多个量子点包埋于有机聚合物中能将量子点的荧光信号进一步放大（同等摩尔数下量子点纳米球的荧光强度是量子点的2863倍），从而显著提高免疫检测灵敏度。同时量子点被聚合物保护，在一定程度上可避免荧光的淬灭，有效提高量子点的稳定性，此外，聚合物表面有官能团修饰，使得量子点的生物适用范围更广。本文将简述量子点免疫层析技术在免疫检测中的应用。
量子点免疫层析相关论文研究领域分布一览
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1 疾病标志物检测
疾病标志物是指可以反映病人疾病状态的体内蛋白、核酸、代谢物等生化指标，可用作为疾病诊断、鉴别、疗效评价、疾病分期、风险评估、愈后监测和健康评价等的辅助性诊断指标。如临床常用的肿瘤标记物，生物标志血清癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特异抗原（PSA）、绒毛膜促性腺激素（HCG）、癌抗原125（CA125）、C反应蛋白（CRP）等。疾病标志物的检测方法多种多样，以免疫检测法最为受到关注。但以胶体金为代表的免疫层析试纸条灵敏度不高，进行多组分分析时需要多个检测带，且以定性检测为主，无法满足对疾病标志物的早期定量检测需求。量子点免疫层析技术因其独特的优势在疾病标志物检测中得到越来越高的重视。
以检测CEA为例，用量子点取代胶体金颗粒作为信号标记物，与待测肿瘤标志物相应抗体偶联后喷涂于结合垫上，该肿标志物的另一位点抗体以及二抗包被于NC膜上，分别形成T带和C带；通过将样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫按一定顺序组装制成免疫层析试纸条。Wu等开发的量子点免疫层析试纸条可实现在25 min内完成CEA检测，检测限可达0.72 ng/mL（临床指标以＜5.0 ng/mL为宜），耗样量仅需40 μL。
Hu等将量子点纳米球应用于血液样品中CRP的免疫层析检测，检测灵敏度较传统胶体金免疫层析试纸条提高257倍，检测限为27.8 pM。
为满足肿瘤标记物的早期同步定量检测，Wang等利用量子点“激发光谱宽，发射光谱较窄且呈对称分布”这一优点构建多色量子点免疫层析试纸条，实现了对130份人体血清样本中AFP和CEA的同步定量检测，检测限分别为3 ng/mL、2 ng/mL，耗样量为80 μL，两种待检物无明显交叉反应。
2 食品安全检测
量子点免疫层析在食品中有害物质检测（食源性致病菌、农兽药残留、生物毒素等）中也得到了广泛研究。对微生物检测主要以双抗夹心法为主。与蛋白等大分子采用抗体夹心法检测不同的是，农兽药残留、生物毒素一般为小分子物质，为半抗原，需修饰载体蛋白成为完全抗原才具有免疫原性，且抗原结合位点较少，因此，对于这类污染物的检测一般采用竞争抑制法。
Ouyang等选用昆道生物研制的量子点纳米球开展黄曲霉毒素总量（AFT）量子点纳米球免疫层析技术研究，实现了对花生和大米基质中靶标物的定量检测。与其研究团队前期以胶体金、时间分辨荧光微球为标记材料建立的免疫层析技术检测灵敏度相比，QDNBs-ICTS方法检测限将近低100倍。胡华军等利用水溶性的 CdTe/ZnSe 核壳量子点与抗克伦特罗多克隆抗体进行共价连接，成功制备了用于检测克伦特罗多的免疫层析试纸条，该试纸条的检测灵敏度高，可用于食品安全的快速灵敏检测。
Tarannova等首次采用量子点的多色性与免疫层析技术相结合，建立了牛奶中多种抗生素残留检测的免疫层析方法，该方法将525、585、625 nm三种发射波长的QDs分别标记抗氧氟沙星（OFL）抗体、抗氯霉素（CAP）抗体、抗链霉素（STM）抗体，然后在试纸条上不同区域划上三条检测线（对应OFL、CAP、STM抗原），在紫外照射下采用CCD图像传感器读取检测线与控制线的荧光强度，建立了可同时检测三种抗生素残留的免疫层析试纸条，对OFL、CAP、STM三种抗生素的 LOD分别达0.3、0.12、0.2 ng/mL，比使用相同抗体建立的ELISA方法要低80-200倍，检测时间更短，灵敏度更高。
3 病毒检测
建立针对动植物病毒的快速、特异性强、灵敏度高的检测技术对于诊断、预防、治疗和流行病学分析具有重要意义。将量子点这一新型材料引入也成为科研者的研究热点。
鸟类流感病毒是高致病性的流感病毒，造成国内家禽的严重疾病甚至死亡，引发人类感染甚至死亡。鸟类A型病毒又可分为很多亚型，其中 H5、H9亚型为常见的引起人类严重呼吸系统疾病。Wu等结合水溶性量子点表面的氨基与相对应亚型鼠源单克隆抗体上的羧基连接作为荧光探针，亚型 H5和 H9相对应的包被抗体分别对应检测线1和检测线2，包被的羊抗鼠 IgG 作为控制线，当样本中存在2种亚型病毒时， 则3条带均有荧光；当只存在亚型 H5 时，则测试线 1 和控制线有荧光；只存在亚型 H9 时，测试线2和控制线有荧光；2种都不存在时，只有控制线有荧光。该方法快速简便、灵敏，其H5 和H9 的检测限为 0.016 HAU 和 0.25 HAU，可在15min内完成检测，这为病毒的早期诊断提供了新方法，从而有效地预防并阻止病毒的扩散。
林彦星等采用量子点作为标记材料对葡萄球菌蛋白A(SPA)进行标记，以抗SPA的多克隆抗体作为质控线的包被蛋白，制备快速检测非洲猪瘟病毒ASFV抗体的量子点免疫层析试纸条。用量子点试纸条和进口 ELISA 试剂盒对临床猪血清样品进行比对检测，除阳性对照外，140 份临床血清样品检测结果全部为阴性，两者符合率为 100％，可用于口岸现场的快速检测或与 ASF 疫区接壤的边境地区开展流行病学监测。
QDs-ICTS 的优势众多，应用范围也愈趋广泛。以上仅是笔者针对这个研究热点，挑选比较具有代表性的检测对象与检测手段，做出的一点浅显解读。量子点免疫层析还有很大的发展空间，值得广大研究者们去努力探索挖掘。昆道专业致力于新型纳米生物诊断系统的开发，与您一起努力，志在为诊断技术的开发注入全部力量，以提高人类生命质量。
参考文献：
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